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    RNAiMAX轉(zhuǎn)染的主要途徑探討

    發(fā)布時間: 2022-04-11  點(diǎn)擊次數(shù): 2753次
       RNAiMAX轉(zhuǎn)染是指將外源分子RNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù),它是研究基因表達(dá)調(diào)控,突變分析等的常規(guī)工具。細(xì)胞轉(zhuǎn)染可分瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時轉(zhuǎn)染是指外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后,存在于游離的載體上,不整合到細(xì)胞的染色體上。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指DNA整合到宿主細(xì)胞的染色體中。
      RNAiMAX轉(zhuǎn)染的一般途徑如下:
      一、物理介導(dǎo)
      1.電穿孔法
      電穿孔靠脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。本法需用特殊設(shè)置(電穿孔儀),把懸浮狀態(tài)的受體細(xì)胞和供體RNA共同放入皿中(或杯中),再施以高壓電脈沖,能夠促進(jìn)RNA通過細(xì)胞膜而進(jìn)入胞內(nèi),并可整合到細(xì)胞的RNA中,使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。若轉(zhuǎn)移的RNA為帶有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒,也可在選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行鑒定。
      2.顯微注射
      本法是借助顯微注射器直接把RNA注射入核內(nèi),使之發(fā)生整合入受體細(xì)胞基因組中的技術(shù)。本技術(shù)需要有嚴(yán)密無菌的凈化室,以免敞開操作污染,同時要能有自動拉針儀以制備顯微針,一般用手動拉針器拉制時要能使針末端有一個0.6cm長的細(xì)部,太長易折斷,針尖開口為2-3μm間,針口小于1μm更佳,針尖開口大于5μm易刺傷細(xì)胞。
      3.基因槍
      基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)??梢詫⒋蠓肿訉?dǎo)入細(xì)胞。
      二、化學(xué)介導(dǎo)
      1.磷酸鈣共沉淀法
      磷酸鈣被認(rèn)為有利于促進(jìn)外源RNA與靶細(xì)胞表面的結(jié)合。氯化鈣+RNA+磷酸緩沖液按一定的比例混合,形成極小的磷酸鈣-RNA復(fù)合物沉淀黏附在細(xì)胞膜表面,借助內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對于轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。
      2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
      中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹RNA,借助脂質(zhì)膜將RNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體則不同,RNA并沒有欲先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負(fù)電的RNA自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成RNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物,從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面,經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。
      3.多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)
      DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染,原理可能是通過內(nèi)吞噬作用而使RNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核,此法只適合暫時轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。不適用與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染時要除去血清。
      三、生物介導(dǎo)
      病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染,以病毒作為載體,通過病毒感染的方式將外源RNA導(dǎo)入到細(xì)胞中,其中以逆轉(zhuǎn)錄病毒及腺病毒轉(zhuǎn)染體系常用。
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