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    ATAC-Seq 實驗操作指南---02 ATAC-Seq 基本操作流程

    發(fā)布時間: 2025-01-08  點擊次數(shù): 137次

    02 ATAC-seq 基本操作流程

    本產(chǎn)品適用于哺乳動物細(xì)胞的染色質(zhì)可及性/開放性研究,針對的細(xì)胞投入量為100-100,000個。

    必須具備的材料

    1ATAC-Seq建庫試劑盒

    Hyperactive ATAC-Seq Library Prep Kit for Illumina (Vazyme #TD711)

    2、建庫接頭

    單端96種接頭(每個貨號對應(yīng)24種接頭):

    TruePrep Index Kit V4 for Illumina (Vazyme #TD204/TD205/TD206/TD207)

    雙端96種接頭:

    TruePrep Index Kit V2 for Illumina (Vazyme #TD202)

    雙端384接頭:

    TruePrep Index Kit V3 for lllumina (Vazyme #TD203)

    3、其他

    Qubit 試劑(Vazyme #EQ121)、PCR儀、磁力架、低吸附EP管、PCR管、無水乙醇

    注意事項:


    6、擴增產(chǎn)物片段分選

    推薦使用ATAC DNA Clean Beads對擴增產(chǎn)物進(jìn)行兩步法片段分選,分選方案為0.55x/1.2x。

    (1)渦旋振蕩混勻ATAC DNA Clean Beads并吸取33 μl(0.55x)至60μl PCR產(chǎn)物中,渦旋振蕩或使用移液器吹打10次充分混勻,室溫孵育5min。

    (2)將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架上,使磁珠與液體分離,待溶液澄清后(約5min)小心轉(zhuǎn)移88μl上清(上清體積=總體積93-5μl)至新的滅菌PCR管中,丟棄磁珠。

    (3)渦旋振蕩混勻ATAC DNA Clean Beads 并吸取72μl(1.2x)至上清中,渦旋振蕩或使用移液器吹打10次充分混勻,室溫孵育5min。

    (4)將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架上,使磁珠與液體分離,待溶液澄清后(約5min)小心移除上清。

    (5)保持反應(yīng)管始終置于磁力架上,加入200μl新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30sec,小心移除上清。

    (6)重復(fù)步驟5,總計漂洗兩次。

    (7)保持反應(yīng)管始終置于磁力架上,開蓋空氣干燥約5min。

    (8)將反應(yīng)管從磁力架上取出,加入22 μl Nuclease-free ddH2O洗脫。渦旋振蕩或使用移液器吹打10次充分混勻,室溫孵育5min。

    (9)將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架上,使磁珠與液體分離,待溶液澄清后(約5min)小心吸取20μl上清至新的滅菌PCR管中,-30~-15℃條件下保存。


    7、文庫質(zhì)控

    1、用Qubit儀器和對應(yīng)的試劑測文庫濃度

    2、安捷倫2100檢測文庫片段分布

    測序技術(shù)參數(shù)推薦

    1、測序策略:lllumina平臺,MGI平臺,PE 150

    2、推薦數(shù)據(jù)量:開放染色質(zhì)區(qū)域的差異鑒定,不低于30M reads/樣本

    ATAC-seq 技術(shù)關(guān)鍵

    樣本準(zhǔn)備

    細(xì)胞活性

    建議細(xì)胞活性>90%,可以使用臺盼藍(lán)染色,進(jìn)行細(xì)胞活力檢測;實驗過程中對細(xì)胞的操作應(yīng)盡量輕柔,以保持細(xì)胞的活性。生長狀態(tài)不佳或死亡的細(xì)胞中,蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合的狀態(tài)會發(fā)生改變,甚至蛋白脫落,變成裸露的DNA,轉(zhuǎn)座子隨機切割可能產(chǎn)生較強的背景噪音,影響實驗結(jié)果。

    細(xì)胞投入量與擴增循環(huán)數(shù)

    受樣本類型的影響,實驗中可兼容的細(xì)胞投入量并不是固定的,早期實驗建議投入50,000-100,000個細(xì)胞。

    文庫產(chǎn)出只要滿足上機需求即可,無需未來獲得更高的文庫產(chǎn)量而設(shè)置過高的擴增循環(huán)數(shù),循環(huán)數(shù)過多會導(dǎo)致過度擴增、偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴增突變積累等多種不良后果。

    特殊樣本流程

    特殊樣本流程摘要

    特殊樣本的核提取以及操作流程可參考以下文獻(xiàn)


    安培生物致力成為推動生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴的合作者

    深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實力、先進(jìn)的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)??偛吭O(shè)在廣東,服務(wù)面向全國。安培生物集進(jìn)口試劑、實驗室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司,旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線,在各個領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品,安培生物致力于為廣大的科研機構(gòu)、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。


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