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    非肌肉肌動(dòng)蛋白的純化

    發(fā)布時(shí)間: 2022-12-06  點(diǎn)擊次數(shù): 835次

    材料與儀器

    非肌肉肌動(dòng)蛋白
    DNA 酶Ⅰ緩沖液
    DEAE 柱

    步驟

    1. 準(zhǔn)備貯存液和材料。

    2x DNA 酶Ⅰ緩沖液:

    20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0

    1 mmol/L DTT

    0.4 mmol/L CaCI2

    0.4 mmol/L ATP

    抑蛋白酶肽

    抑蛋白酶

    亮抑蛋白酶肽

    抑胃酶肽 A

    PMSF

    TPCK

    50% 甲醛在 DNA 酶柱緩沖液中

    0.4 mol/L NH4CI 在 DNA 酶Ⅰ緩沖液中

    0.3 mol/L KCl 在 DNA 酶Ⅰ緩沖液中

    DNA酶Ⅰ柱緩沖液

    2. 準(zhǔn)備一個(gè) 5~10 ml 的 DNA 酶Ⅰ的親和柱。

    3. 準(zhǔn)備一個(gè) 0.2 ~1 ml 的 DEAE 柱:用 DNA 酶Ⅰ緩沖液平衡的 DEAE-纖維素。

    4. 通過離心收集細(xì)胞并用等滲鹽溶液(例如 PBS ) 洗去培養(yǎng)液。

    5. 在加蛋白酶抑制劑的 DNA 酶柱緩沖液中重懸細(xì)胞沉淀物。

    6. 用對(duì)于感興趣細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行細(xì)胞勻漿。

    7. 用相差顯微鏡證實(shí)超過 99% 的細(xì)胞已經(jīng)裂解了。

    8. 100000 g 離心裂解物 45 分鐘。

    9. 用巴斯德吸管轉(zhuǎn)移上清,避免混入脂肪。

    10. 柱子上樣:

    (1) 上清和用 DNA 酶Ⅰ緩沖液加蛋白酶抑制劑平衡了的 DNA 酶Ⅰ親和介質(zhì)混合,并把介質(zhì)/蛋白混合物倒到一個(gè)小桿子中。

    (2) 在裝填柱子時(shí)收集流出液,通過用抗肌動(dòng)蛋白抗體進(jìn)行的免疫印跡、DNA 酶Ⅰ抑制分析或 SDS-PAGE 來證實(shí)有大量肌動(dòng)蛋白留在柱子中。

    11. 用 2 倍體積含蛋白酶抑制劑的 DNA 酶柱緩沖液洗柱子,然后用含蛋白酶抑制劑和 0.4 mol/L NH4Cl 的 DNA 酶柱緩沖液洗柱子。

    12. 用含 50% 甲醛的 DNA 酶Ⅰ柱緩沖液洗脫肌動(dòng)蛋白。

    13. 立即把 50% 甲醛洗脫液上樣到 0.2~1 ml DEAE 柱子上。

    14. 用 5 倍體積的 DNA 酶Ⅰ柱緩沖液洗 DEAE 柱,然后用含 0.3 mol/L KCl 的 DNA 酶Ⅰ柱緩沖液洗脫。分部收集,每管 200 μl。

    15. 檢測(cè)收集液的蛋白濃度,然后混合出峰時(shí)的收集液。

    16. 加 MgCl2 使?jié)舛葹?2 mmol/L ( 這是選用于天然肌動(dòng)蛋白),以使肌動(dòng)蛋白聚合,用 SDS-PAGE 分析多肽組成。

    產(chǎn)量應(yīng)該是 5% 左右,所以從濕重 10 g 的細(xì)胞指望得到 2.5~5 mg 純化了的肌動(dòng)蛋白是合理的。


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